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《保健食品原料用菌種安全性檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(2020年版)》

2020-10-31

根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》,經(jīng)與國家衛(wèi)生健康委協(xié)商一致,市場監(jiān)管總局制定了《保健食品及其原料安全性毒理學(xué)檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(2020年版)》《保健食品原料用菌種安全性檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(2020年版)》《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(2020年版)》,現(xiàn)予印發(fā),自公告之日起施行。

附件:《保健食品及其原料安全性毒理學(xué)檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(2020年版)》《保健食品原料用菌種安全性檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(2020年版)》《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(2020年版)》

市場監(jiān)管總局

2020年10月16日

保健食品原料用菌種安全性

檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(2020年版)

1 范圍

本指導(dǎo)原則規(guī)定了保健食品原料用細(xì)菌、絲狀真菌(子實體除外)和酵母的安全性評價中的致病性(毒力)檢驗與評價程序和方法。

本指導(dǎo)原則適用于保健食品原料用菌種(包括保健食品配方用及原料生產(chǎn)用菌種)的致病性檢驗與評價。

本指導(dǎo)原則不適用于基因改造微生物菌種和在我國無使用習(xí)慣的菌種致病性檢驗與評價。

2 術(shù)語和定義

2.1 致病性,Pathogenicity

微生物感染宿主造成健康損害引起疾病的能力。

2.2 產(chǎn)毒能力,Toxigenicity

微生物產(chǎn)生對人和動物有毒作用的活性代謝產(chǎn)物的能力。

2.3 毒性,Toxicity

微生物及其代謝產(chǎn)物對機體可能造成的潛在傷害(不良反應(yīng))。

3 對擬評價微生物菌種需提交的基本資料要求

在進(jìn)行致病性評價試驗前,菌種送檢單位需提供以下資料供評價單位審核。

3.1 基本信息

擬評價菌種名稱(包括學(xué)名、俗名、曾用名、拉丁名等)、來源及用途。

3.2 菌種分類學(xué)資料

提供由有菌種鑒定資質(zhì)的機構(gòu)出具的對擬評價菌種的規(guī)范、科學(xué)的分類學(xué)(屬、種名稱及株)資料。細(xì)菌的分類和命名應(yīng)遵循原核生物分類學(xué)國際委員會(International Committee on Systematics of Prokaryotes)的規(guī)定,并符合原核生物國際命名法規(guī)(International Code ofNomenclature of Prokaryotes)要求。真菌的分類和命名應(yīng)按國際藻類、真菌和植物命名法規(guī)(International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants)進(jìn)行。

3.3 菌種鑒定資料

根據(jù)目前已有的知識,提供基于表型及基因測序技術(shù)鑒定到種水平的資料。作為保健食品的功效成分(活菌),還應(yīng)提供鑒定到株水平的資料。

3.4 菌種生長環(huán)境條件資料

提供擬評價菌種生長最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件(培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和濕度、光照等),以及菌種保藏及復(fù)壯方法等相關(guān)資料。

3.5 誘變菌種

經(jīng)過誘變的菌種還需提供詳細(xì)的菌種誘變方法(包括使用的誘變劑、誘變條件及誘變試驗流程等)和不少于100代(傳代間隔不少于7天)的遺傳穩(wěn)定性研究報告。

3.6 生產(chǎn)相關(guān)信息

包括但不限于擬評價菌種安全用于保健食品的生產(chǎn)記錄、工藝流程、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等資料。

3.7 國內(nèi)外安全性評價資料綜述

基于國內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù),提供擬評價菌種的國內(nèi)外使用歷史和安全性評價資料,包括其致病性和產(chǎn)毒能力的報告、研究文獻(xiàn)或綜述等;若無擬評價菌種的上述資料,應(yīng)提供在親緣關(guān)系上與其相近種屬的安全性評價資料。

3.8 其他國家批準(zhǔn)資料

提供其他國家已批準(zhǔn)擬評價菌種作為膳食補充劑、功能食品或普通食品生產(chǎn)使用的相關(guān)證明資料。

3.9 其他需要說明的信息。

4 評價方法

對已經(jīng)提供以上資料的擬評價菌株,可以按照以下方法開展評價。

4.1 全基因組測序(Whole Genome Sequencing, WGS)

4.1.1 基因測序

對擬評價菌株進(jìn)行全基因組測序,分別獲得其基因組完成圖和框架圖,測序報告應(yīng)包括(但不限于)以下信息:

- DNA提取方法

- 測序方案及儀器設(shè)備

- 序列組裝方法

- 序列質(zhì)量評價

- FASTA文件

- 與預(yù)期基因組大小相關(guān)的重疊群(Contigs)總長度

- 基因注釋流程

- 對真菌而言,還需提供從相關(guān)數(shù)據(jù)庫中獲得的全基因組注釋質(zhì)量信息。

4.1.2 基因序列分析

將擬評價菌株的全基因組序列與已有的數(shù)據(jù)庫,包括但不限于毒力基因數(shù)據(jù)庫(VFDB)、毒力/致病島數(shù)據(jù)庫(PAIDB)、生物防御數(shù)據(jù)庫(MvirDB)等最新版本中存儲的序列進(jìn)行比對,并分析擬評價菌株遺傳物質(zhì)中與致病明確相關(guān)的已知毒力因子和毒素代謝相關(guān)基因的存在情況。應(yīng)提供包括(但不限于)以下信息的分析報告:

- 毒力/致病性(或產(chǎn)毒)相關(guān)基因名稱、所在位置、與最新數(shù)據(jù)庫中已有毒力基因的匹配度等信息

- 編碼的蛋白及序列號

- 毒力/致病因子(毒素產(chǎn)生、侵襲和粘附因子等)

- 序列長度覆蓋度≥60%

- 輸入序列與數(shù)據(jù)庫中序列的匹配度(≥85%)和e值(<10-5)

- 數(shù)據(jù)庫中已有的菌株名稱

- 基因組圖譜

- 擬評價的真菌菌株還應(yīng)根據(jù)文獻(xiàn)報道能夠產(chǎn)生的毒素類別,針對性檢索是否存在毒素合成關(guān)鍵基因及其基因簇。

4.2 動物致病性試驗

由具備菌種致病性檢驗和評價資質(zhì)的機構(gòu),分別按照附錄A、附錄B和附錄C規(guī)定的試驗方案,對擬評價的保健食品用細(xì)菌、絲狀真菌、酵母菌株開展致病性檢驗,對結(jié)果做出評價并出具報告。

4.3 產(chǎn)毒試驗

對某些能夠產(chǎn)生毒素的微生物,應(yīng)在多種基質(zhì)和條件下(單品種固體、多品種固體復(fù)合、不同成分的液體組合等)進(jìn)行產(chǎn)毒試驗,并按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法或國際組織/相關(guān)國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進(jìn)行有毒活性代謝產(chǎn)物含量檢測。

5 結(jié)果判定

5.1 滿足以下所有條件者,可用于保健食品。

5.1.1 動物試驗顯示無致病性。

5.1.2 產(chǎn)毒試驗結(jié)果顯示,在受試的任何一種基質(zhì)中均不產(chǎn)生有毒活性代謝產(chǎn)物。

5.1.3 根據(jù)現(xiàn)有知識,全基因組序列分析未發(fā)現(xiàn)存在已知的毒力/致病基因(或毒素合成關(guān)鍵基因及其基因簇)。

5.2 全基因組序列中發(fā)現(xiàn)含有已知毒力/致病基因(或毒素合成關(guān)鍵基因及其基因簇),但動物試驗顯示不具有致病性、或產(chǎn)毒試驗檢測到已知的有毒活性代謝產(chǎn)物但其水平較低,長期攝入對人體健康無影響,結(jié)合國內(nèi)外使用歷史,可用于保健食品。

5.3 動物試驗顯示具有致病性,或產(chǎn)生高水平已知有毒代謝產(chǎn)物,長期攝入可能影響人體健康,不能用于保健食品。

附錄A

(規(guī)范性附錄)

保健食品原料用細(xì)菌致病性檢驗方法

1 范圍

本方法規(guī)定了保健食品原料用細(xì)菌的致病性檢驗方法。

本方法適用于保健食品原料用細(xì)菌的致病性檢驗。

2 設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌和培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備與材料如下:

2.1 恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。

2.2 離心機:離心力³3000 ´ g。

2.3 電子天平:感量0.1 g 和0.001 g。

2.4 比濁儀。

2.5 溫濕度計。

2.6 顯微鏡:10×~100×。

2.7 厭氧培養(yǎng)裝置:厭氧罐、厭氧箱。

2.8 無菌錐形瓶:容量100 mL、500 mL。

2.9 無菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

2.10 無菌試管:16 mm×160 mm。

2.11 無菌培養(yǎng)皿:直徑90 mm。

2.12 無菌量筒:容量100 mL。

2.13 微量移液器及配套槍頭:量程為100 μL~1000 μL。

2.14 注射器:量程為100 μL~1000 μL。

2.15 小鼠灌胃針頭。

3 培養(yǎng)基和試劑

3.1 無菌生理鹽水:商品化的生理鹽水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸餾水中,分裝后121℃高壓滅菌15 min,備用。

3.2LB肉湯培養(yǎng)基:商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制,充分加熱溶解后分裝,121℃高壓滅菌15 min,備用。

3.3LB瓊脂平板:商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制,充分加熱溶解后分裝,121℃高壓滅菌15 min,制備LB瓊脂平板,備用。

3.4 半胱氨酸鹽酸鹽儲備液:稱取500 mg半胱氨酸鹽酸鹽于50 mL無菌離心管中,加入10 mL蒸餾水,充分溶解后用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

3.5 含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基:商品化MRS肉湯培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制,充分加熱溶解后分裝,121℃高壓滅菌15 min,待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時,加入按3.4制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲備液,使培養(yǎng)基中半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500μg/mL,備用。

3.6 含有半胱氨酸鹽酸鹽MRS瓊脂平板:商品化MRS瓊脂培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制,充分加熱溶解后分裝,121℃高壓滅菌15 min,待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時,加入按3.4制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲備液,使培養(yǎng)基中半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500 μg/mL,用于制備含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板。

3.7 含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板:商品化雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制,充分加熱溶解后分裝,121℃高壓滅菌15 min,待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時,加入3.4中制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲備液,使半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500 μg/mL,用于制備含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板。

4 實驗動物

選用SPF級昆明或ICR健康成年小鼠,雌雄各半,體重范圍為18.0 g~22.0 g。

5 操作步驟

所有擬評價的菌株必須使用腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑給予動物受試物,以評價不同受試物暴露途徑對動物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌株活化

目前我國已批準(zhǔn)的可用于保健食品的細(xì)菌主要是雙歧桿菌屬和乳桿菌屬,除這兩個屬以外的其他新申報菌種在以下描述中均使用“其他細(xì)菌”。

根據(jù)送檢菌株的保存狀態(tài),將雙歧桿菌和乳桿菌首先接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯、其他細(xì)菌接種LB肉湯或適于該菌生長的最適液體培養(yǎng)基中,并置適宜的培養(yǎng)條件下(包括培養(yǎng)溫度、濕度,厭氧、需氧、微需氧等)培養(yǎng)一定時間(培養(yǎng)時間長短視不同菌種而異)。

5.1.2 菌懸液制備

將5.1.1中活化的雙歧桿菌接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板或含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板(乳桿菌接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板,其他細(xì)菌接種LB瓊脂平板或適應(yīng)于該菌生長的最適培養(yǎng)基瓊脂平板),在規(guī)定的適宜培養(yǎng)條件下(包括培養(yǎng)溫度、濕度,厭氧、需氧、微需氧等)培養(yǎng)一定時間(培養(yǎng)時間長短視不同菌種而異)后,刮取平板上的菌落,將其懸浮于無菌生理鹽水中,充分混勻后,用適量無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度并比濁,使最終菌懸液中的菌濃度達(dá)到5.0×107 CFU/mL,用于小鼠腹腔注射。

5.1.3注射

小鼠不少于40只,雌雄各半,隨機分成4組(每組不少于10只),包括雄性小鼠無菌生理鹽水對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠無菌生理鹽水對照組、雌性小鼠菌懸液組。每只小鼠注射0.2 mL,即受試物組每只小鼠注射菌量不少于1.0×107 CFU。

5.1.4觀察

動物腹腔注射后每天觀察1次,至少連續(xù)觀察21 d。

觀察并記錄小鼠皮膚和毛、眼睛和粘膜、呼吸情況、肢體活動、行為方式等有無異常。特別注意觀察是否出現(xiàn)振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現(xiàn)象。試驗前稱量并記錄所有小鼠的體重,試驗結(jié)束后稱量并記錄所有存活小鼠的體重。對于試驗期間死亡的小鼠,盡可能精確記錄小鼠的死亡時間,同時稱重并記錄。

5.2 經(jīng)口灌胃

5.2.1 菌數(shù)預(yù)估

無菌吸取上述5.1.1的培養(yǎng)液,分別加至兩個無菌離心管中,每管1 mL,3000 ´g 離心10 min,棄去上清液后,用適量無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度并比濁,使最終菌懸液中菌的濃度分別不低于2.5×108 CFU/mL和1.25×109 CFU/mL,并分別記錄每mL培養(yǎng)液離心后所得沉淀物中細(xì)菌數(shù)調(diào)整至2.5×108 CFU/mL和1.25×109 CFU/mL時需加入的無菌生理鹽水的體積(mL)。

5.2.2 菌懸液制備

5.2.2.1 培養(yǎng)上清液的制備

根據(jù)受試動物總數(shù)和每只動物的灌胃體積計算所需要的受試菌株培養(yǎng)液用量。吸取5.1.1培養(yǎng)液,將培養(yǎng)液一分為二,3000 ´ g 各離心10min后,將上清液分別轉(zhuǎn)至100mL無菌量筒中,一份上清液用于菌懸液原液的制備,另一份上清液冷凍濃縮至原體積的五分之一,作為5倍濃縮上清液,備用。

5.2.2.2 菌懸液原液的制備

按照5.2.1中獲得的細(xì)菌終濃度達(dá)到2.5×108 CFU/mL所需要的生理鹽水體積,根據(jù)離心的培養(yǎng)物體積,按相同比例加入5.2.2.1獲得的上清液,調(diào)整離心后的沉淀物使其細(xì)菌數(shù)達(dá)到2.5×108 CFU/mL(上清液量不夠時可用空白培養(yǎng)基補齊)。

5.2.2.3濃縮菌懸液的制備

按照5.2.1中獲得的細(xì)菌終濃度達(dá)到1.25×109 CFU/mL所需要的生理鹽水體積,根據(jù)離心的培養(yǎng)物體積,按相同比例加入5.2.2.1獲得的5倍濃縮上清液,調(diào)整離心后的沉淀物使其細(xì)菌數(shù)達(dá)到1.25×109 CFU/mL。

5.2.3 灌胃

小鼠不少于80只,雌雄各半,分別隨機分成8組(每組不少于10只),包括雄性小鼠培養(yǎng)基對照組、雄性小鼠菌懸液組、雄性小鼠5倍濃縮培養(yǎng)基對照組、雄性小鼠5倍濃縮菌懸液組;雌性小鼠培養(yǎng)基對照組、雌性小鼠菌懸液組、雌性小鼠5倍濃縮培養(yǎng)基對照組、雌性小鼠5倍濃縮菌懸液組。各組均以20 mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃,連續(xù)灌胃3 d,首次灌胃前小鼠應(yīng)禁食過夜(16 h),灌胃后3 h~4 h喂食。

5.2.4 觀察

動物經(jīng)口灌胃后每天觀察1次,至少連續(xù)觀察21 d,觀察指標(biāo)同5.1.4。

6 結(jié)果與報告

對5.1和5.2的動物試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和綜合評價,包括:

(1)受試物對動物一般健康情況有無不良影響。

(2)受試物對動物體重等指標(biāo)的影響。

(3)受試物組動物死亡情況。

(4)若受試物組動物在試驗期間未出現(xiàn)中毒癥狀或死亡,且體重等指標(biāo)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義,即可判定該菌株無致病性;若受試物組動物在試驗期間出現(xiàn)中毒癥狀或死亡,或試驗期間體重等指標(biāo)與對照組相比有顯著性差異,即可判定該菌株具有致病性。

附錄B

(規(guī)范性附錄)

保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗方法

1 范圍

本方法規(guī)定了保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗方法。

本方法適用于保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗。

2 設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:

2.1 恒溫培養(yǎng)箱:28℃±1℃。

2.2 電子天平:感量為0.1 g。

2.3 錐形瓶:容量為500 mL。

2.4 無菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

2.5 顯微鏡:10×~100×。

2.6 微量移液器及配套槍頭:量程為100 μL~1000 μL。

2.7 血球計數(shù)板。

2.8 注射器:量程為100 μL~1000 μL。

2.9 小鼠灌胃針頭。

2.10 溫濕度計。

2.11 接種鉤。

2.12 球磨儀或功能相當(dāng)?shù)膬x器。

2.13 無菌培養(yǎng)皿:直徑90 mm。

3 培養(yǎng)基和試劑

3.1 麥芽汁瓊脂平板:商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制,充分加熱溶解后分裝,121℃高壓滅菌15 min,制備麥芽汁瓊脂平板,備用。

3.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板:商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制,充分加熱溶解后分裝,121℃高壓滅菌15 min,制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板,備用。

3.3 無菌生理鹽水:商品化的生理鹽水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸餾水中,分裝后121℃高壓滅菌15 min,備用。

如擬評價菌株在上述兩種培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)和產(chǎn)孢子量均不理想,可選用適于該菌株生長和產(chǎn)孢的其他培養(yǎng)基。

4 實驗動物

選用SPF級昆明或ICR健康小鼠,雌雄各半,體重范圍為18.0 g~22.0 g。

5 操作步驟

所有擬評價菌株必須使用腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑給予動物受試物,以評價不同受試物暴露途徑對動物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌懸液制備

5.1.1.1 產(chǎn)孢子量大的菌株:將擬評價菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板(紅曲霉屬菌株接種麥芽汁瓊脂平板)或適于擬評價菌株生長的培養(yǎng)基平板,28℃±1℃培養(yǎng)7 d~14 d后,挑取平板上的孢子,將其懸浮于無菌生理鹽水中,充分混勻后,用血球計數(shù)板計數(shù)孢子濃度,并用適量無菌生理鹽水調(diào)整,使其最終濃度不低于5.0×107 CFU/mL。

5.1.1.2 產(chǎn)孢子量少或不產(chǎn)孢子的菌株:將擬評價菌株接種于適宜的培養(yǎng)基上, 28℃±1℃下培養(yǎng)7 d~14 d或在適宜的誘導(dǎo)產(chǎn)孢條件下培養(yǎng)一定時間后,挑取平板的菌絲體及孢子,用球磨儀(或其他功能相當(dāng)?shù)膬x器)將菌絲體磨碎,經(jīng)生理鹽水重懸后,用血球計數(shù)板計數(shù),并用適量無菌生理鹽水調(diào)整,使菌懸液中菌絲體片段數(shù)/孢子的最終濃度不低于5.0×107 CFU/mL。

5.1.2 注射

小鼠不少于40只,雌雄各半,分別隨機分成4組(每組不少于10只),包括雄性小鼠生理鹽水對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水對照組、雌性小鼠菌懸液組,每只小鼠注射0.2 mL,即受試物組每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU。

5.1.3觀察

動物腹腔注射后每天觀察1次,至少連續(xù)觀察21 d,觀察指標(biāo)同附錄A中的5.1.4。

5.2 經(jīng)口灌胃

5.2.1 菌懸液制備

除制備的菌懸液中真菌孢子/菌絲體片段的濃度不低于2.5×108 CFU/mL外,其他操作步驟同5.1.1。

5.2.2 灌胃

小鼠不少于40只,雌雄各半,分別隨機分成4組(每組不少于10只),包括雄性小鼠生理鹽水對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水對照組、雌性小鼠菌懸液組,各組均以20 mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃1次,灌胃前禁食過夜(16 h),灌胃后3 h~4 h喂食。

5.2.3 觀察

動物經(jīng)口灌胃后每天觀察1次,至少連續(xù)觀察21 d,觀察指標(biāo)同附錄A中的5.1.4。

6 結(jié)果與報告

對5.1和5.2的動物試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和綜合評價,內(nèi)容同附錄A中的條款6。

附錄C

(規(guī)范性附錄)

保健食品原料用酵母的致病性檢驗方法

1 范圍

本方法規(guī)定了保健食品原料用酵母的致病性檢驗方法。

本方法適用于保健食品原料用酵母的致病性檢驗。

2 設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:

2.1 恒溫培養(yǎng)箱:28℃±1℃。

2.2 電子天平:感量為0.1 g。

2.3 錐形瓶:容量為500 mL。

2.4 無菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

2.5 顯微鏡:10×~100×。

2.6 微量移液器及配套槍頭:量程為100 μL~1000 μL。

2.7 血球計數(shù)板。

2.8 注射器:量程為100 μL~1000 μL。

2.9 小鼠灌胃針頭。

2.10 溫濕度計。

2.11 接種環(huán)。

2.12 離心機:離心力³3000 ´ g。

2.13 無菌培養(yǎng)皿:直徑90 mm。

2.14 無菌量筒:容量100 mL。

3 培養(yǎng)基和試劑

3.1 麥芽汁瓊脂平板:商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制,充分加熱溶解后分裝,121℃高壓滅菌15 min,制備麥芽汁瓊脂平板,備用。

3.2 麥芽汁培養(yǎng)基:商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制,充分加熱溶解后分裝,121℃高壓滅菌15 min,制備麥芽汁培養(yǎng)基,備用。

3.3 無菌生理鹽水:商品化的生理鹽水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸餾水中,分裝后121℃高壓滅菌15 min,備用。

如擬評價菌株在麥芽汁培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)不理想,可選用適于該菌株生長的其他培養(yǎng)基。

4 實驗動物

選用SPF級昆明或ICR健康小鼠,雌雄各半,體重范圍為18.0 g~22.0 g。

5 操作步驟

所有擬評價菌株必須使用腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑給予動物受試物,以評價不同受試物暴露途徑對動物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌懸液制備

將擬評價菌株接種麥芽汁瓊脂平板,28℃±1℃培養(yǎng)一定時間(培養(yǎng)時間長短視不同菌種而異)后,刮取平板上的菌落,將其懸浮于無菌生理鹽水中,充分混勻后用血球計數(shù)板計數(shù),并用適量無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度,使菌懸液中菌的最終濃度不低于5.0×107 CFU/mL。

5.1.2注射

小鼠不少于40只,雌雄各半,分別隨機分成4組(每組不少于10只),包括雄性小鼠生理鹽水對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水對照組及雌性小鼠菌懸液組,每只小鼠注射0.2 mL,即受試物組每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU。

5.1.3觀察

動物腹腔注射后每天觀察1次,至少連續(xù)觀察21 d,觀察指標(biāo)同附錄A中的5.1.4。

5.2 經(jīng)口灌胃

5.2.1 菌株培養(yǎng)

將菌株接種到麥芽汁培養(yǎng)基上,28℃±1℃培養(yǎng)一定時間(培養(yǎng)時間長短視不同菌種而異)后,備用。

5.2.2 菌數(shù)預(yù)估

無菌吸取上述5.2.1的培養(yǎng)液,分別加至兩個無菌離心管中,每管1 mL,3000 ´ g 離心10 min,棄去上清液后,用適量無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度并計數(shù),使最終菌懸液中菌的濃度分別不低于2.5×108 CFU/mL和6.25×108 CFU/mL,并分別記錄每mL培養(yǎng)液離心后所得沉淀物中酵母菌數(shù)調(diào)整至2.5×108 CFU/mL和6.25×108 CFU/mL時加入無菌生理鹽水的體積(mL)。

5.2.3 菌懸液制備

5.2.3.1 培養(yǎng)上清液的制備

根據(jù)受試動物總數(shù)和每只動物的灌胃體積計算所需要的受試菌株培養(yǎng)液用量,繼而將培養(yǎng)液一分為二,3000 ´ g 各離心10 min后,將上清液分別轉(zhuǎn)至100 mL無菌量筒中,一份上清液作為菌懸液原液的制備,另一份上清液冷凍濃縮至原體積的五分之二,作為2.5倍濃縮上清液,備用。

5.2.3.2 菌懸液原液的制備

按照5.2.2中獲得的酵母終濃度達(dá)到2.5×108 CFU/mL所需要的生理鹽水體積,根據(jù)離心的培養(yǎng)物體積,按相同比例加入5.2.3.1獲得的上清液,調(diào)整離心后的沉淀物使其酵母數(shù)達(dá)到2.5×108 CFU/mL(上清液量不夠時可用空白培養(yǎng)基補齊)。

5.2.3.3 濃縮菌懸液的制備

按照5.2.2中獲得的酵母菌終濃度達(dá)到6.25×108 CFU/mL所需要的生理鹽水體積,根據(jù)離心的培養(yǎng)物體積,按相同比例加入5.2.3.1獲得的培養(yǎng)上清液2.5倍濃縮液,調(diào)整離心后的沉淀物使其菌數(shù)達(dá)到6.25×108 CFU/mL。

5.2.4 灌胃

小鼠不少于80只,雌雄各半,分別隨機分成8組(每組不少于10只),包括雄性小鼠培養(yǎng)基對照組、雄性小鼠菌懸液組、雄性小鼠2.5倍濃縮培養(yǎng)基對照組、雄性小鼠2.5倍菌懸液組;雌性小鼠培養(yǎng)基對照組、雌性小鼠菌懸液組、雌性小鼠2.5倍濃縮培養(yǎng)基對照組及雌性小鼠2.5倍菌懸液組。各組均以20 mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃1次,灌胃前應(yīng)禁食過夜(16 h),灌胃后3 h~4 h喂食。

5.2.5 觀察

動物經(jīng)口灌胃后每天觀察1次,至少連續(xù)觀察21 d,觀察指標(biāo)同附錄A中的5.1.4。

6 結(jié)果與報告

對5.1和5.2的動物試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和綜合評價,內(nèi)容同附錄A中的條款6。


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