受國家衛(wèi)生健康委員會委托，國家食品安全風險評估中心承擔新食品原料、食品添加劑新品種、食品相關產(chǎn)品新品種（以下簡稱“三新食品”）技術評審工作。按照國家衛(wèi)生健康委員會和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的相關要求，對符合“三新食品”申報條件的、生產(chǎn)加工過程中涉及遺傳修飾微生物的產(chǎn)品，申請人應按照附件要求在新食品原料、食品相關產(chǎn)品新品種申報資料的生產(chǎn)工藝部分，食品添加劑新品種安全性評估資料的生產(chǎn)工藝部分提交相關資料。

——附件

食品加工用遺傳修飾微生物安全性評價申報材料要求（試行）

　　申請人申報使用遺傳修飾微生物生產(chǎn)新食品原料、食品添加劑新品種和食品相關產(chǎn)品新品種（以下簡稱“三新食品”），產(chǎn)品中不含有新引入基因片段和遺傳修飾微生物時，應按本文件提交相關資料。

　　1. 產(chǎn)品信息

　　1.1 產(chǎn)品的組成、目標產(chǎn)物含量等檢測數(shù)據(jù)

　　1.2 產(chǎn)品中外源基因殘留檢測數(shù)據(jù)

　　應詳細描述生產(chǎn)過程中去除外源基因的處理工藝步驟和參數(shù)，并提供產(chǎn)品中無外源引入基因殘留的檢測報告。采用聚合酶鏈式反應（PCR）方法對生產(chǎn)菌株的特定脫氧核糖核酸（DNA）片段（包括目的基因、報告基因、標記基因等）進行檢測。PCR方法涉及的樣品采集、DNA提取、PCR擴增和質(zhì)量控制要求見附件1。

　　1.3 產(chǎn)品中遺傳修飾微生物殘留檢測數(shù)據(jù)

　　應詳細描述生產(chǎn)過程中滅活和去除遺傳修飾微生物的工藝步驟和參數(shù)，并提供產(chǎn)品中無遺傳修飾微生物活細胞殘留的檢測報告。采用微生物培養(yǎng)法對產(chǎn)品進行遺傳修飾微生物活細胞檢測。具體的樣品采集、樣品前處理、培養(yǎng)和觀察、菌落計數(shù)、質(zhì)量控制和鑒定確認要求見附件2。

　　1.4 環(huán)境風險控制措施及效果

　　應提供無環(huán)境釋放風險承諾書及其支持資料，包括但不限于生產(chǎn)過程中確保遺傳修飾微生物及其外源基因不會進入環(huán)境和發(fā)生基因轉(zhuǎn)移的防控措施，及其效果評價數(shù)據(jù)和報告（如生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢氣、廢水、廢渣中無可繁殖、可轉(zhuǎn)移的遺傳修飾微生物殘留的至少3批次檢測數(shù)據(jù)）。

　　1.5 產(chǎn)品分類說明

　　依據(jù)以上數(shù)據(jù)及報告，對產(chǎn)品做出分類。Ⅰ類為純化產(chǎn)品，Ⅱ類為復合產(chǎn)品。

　　2. 遺傳修飾微生物相關信息 

　　2.1 基本信息

　　名稱（包括中文名、拉丁名、別名等）、菌株號、來源及用途。

　　2.2 分類學及鑒定資料

　　提供基于表型、基因型和最新測序技術鑒定到種或亞種水平的鑒定報告。

　　2.3 生物學特性資料

　　包括但不限于遺傳修飾微生物的表型及顯微鏡下特征、理化特性等。

　　2.4 生長環(huán)境條件資料

　　提供遺傳修飾微生物生長的適宜培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件（包括但不限于培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和濕度、需氧情況、光照等），以及遺傳修飾微生物保藏及復壯方法等相關資料。

　　2.5 其他國家法規(guī)資料

　　提供其他國家已經(jīng)批準或認可的該遺傳修飾微生物生產(chǎn)產(chǎn)品的相關法規(guī)資料。

　　2.6 食品加工用遺傳修飾微生物的安全性評價

　　2.6.1 遺傳修飾微生物在自然界的存活能力，遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到其他生物體的能力和可能后果；

　　2.6.2 遺傳修飾微生物的安全性

　　（1）基于全基因組測序進行的毒力基因、耐藥基因、毒素產(chǎn)生相關基因等分析；

　　（2）遺傳修飾微生物的致病性、耐藥性和產(chǎn)毒能力試驗報告；

　　（3）遺傳修飾微生物新引入基因表達產(chǎn)物應提供與已知毒性蛋白或毒素的同源性生物信息學比對資料，以及與已知致敏原的同源性生物信息學比對資料；

　　（4） 遺傳修飾微生物新引入基因表達產(chǎn)物為非蛋白質(zhì)類的產(chǎn)品，還應提供至少3批次樣品蛋白殘留數(shù)據(jù)；

　　（5）結(jié)合全基因組測序數(shù)據(jù)，分析潛在的脫靶位點與脫靶情況，如有脫靶情況發(fā)生，應分析可能造成的非預期效應；

　　（6）其他安全性資料。

　　2.6.3 確定遺傳修飾微生物的安全等級。

　　3. 受體微生物的安全性評價

　　3.1 背景資料

　　3.1.1 名稱（包括中文名、拉丁名、別名等）、菌株號、來源；

　　3.1.2 分類學資料；

　　3.1.3 明確是天然野生菌種還是人工培養(yǎng)菌種，如為人工培養(yǎng)菌種，應提供原始菌株的信息；

　　3.1.4 安全性背景資料：包括但不限于在國內(nèi)外的應用情況，長期安全應用記錄，對人類健康或生態(tài)環(huán)境是否產(chǎn)生過不良影響，是否有演變?yōu)橛泻ι锏目赡苄浴?/span>

　　3.2 生物學特性

　　3.2.1 生長周期和世代時間；

　　3.2.2 繁殖方式和繁殖能力；

　　3.2.3 適宜生長的營養(yǎng)要求；

　　3.2.4 在環(huán)境中定殖、存活和傳播的方式、能力及其影響因素；

　　3.2.5 對人體健康和動物的潛在風險（包括毒性、致病性、耐藥性等）；

　　3.2.6 其他生物學特性。

　　3.3 適應的生態(tài)環(huán)境

　　3.3.1 在國內(nèi)的地理分布和自然生長環(huán)境，其自然分布是否會因某些條件的變化而改變；

　　3.3.2 生長所需的生態(tài)環(huán)境條件，包括溫度、濕度、酸堿度、光照、空氣等；

　　3.3.3 是否具有生態(tài)特異性，如在環(huán)境中的適應性等；

　　3.3.4 與生態(tài)系統(tǒng)中其他微生物的生態(tài)關系，是否受人類和動物病原體（如病毒）的侵染。包括生態(tài)環(huán)境的改變對這種（些）關系的影響以及是否會因此而產(chǎn)生或增加對人類健康和生態(tài)環(huán)境的不良影響；

　　3.3.5 對生態(tài)環(huán)境的影響及其潛在風險。

　　3.4 遺傳變異

　　3.4.1 遺傳穩(wěn)定性；

　　3.4.2 質(zhì)粒狀況，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及其潛在風險；

　　3.4.3 轉(zhuǎn)座子狀況及其潛在風險；

　　3.4.4 是否有發(fā)生遺傳變異而對人類健康或生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不良影響的可能性；

　　3.4.5 在自然條件下與其他微生物（特別是病原體）進行遺傳物質(zhì)交換的可能性。

　　3.5 其他資料

　　3.6 安全等級

　　4. 基因操作的安全性評價

　　4.1 食品加工用遺傳修飾微生物中引入或修飾性狀和特性的描述

　　4.2 實際插入或刪除序列的資料

　　4.2.1 插入序列的大小和結(jié)構(gòu)，確定其特性的分析方法；

　　4.2.2 刪除區(qū)域的大小和功能；

　　4.2.3 目的基因的安全性；

　　詳細描述目的基因的供體來源、核苷酸序列和推導的氨基酸序列、功能和安全性。

　　（1）結(jié)構(gòu)：完整的DNA或反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸（cDNA）序列和推導的氨基酸序列；

　　（2）供體微生物的來源；

　　（3）供體微生物的生物學特性及生物學功能等；

　　（4）安全性：從供體微生物特性、安全使用歷史、基因結(jié)構(gòu)、毒性、致病性、耐藥性、功能等方面綜合描述目的基因的安全性。

　　4.2.4 插入序列的拷貝數(shù)。

　　4.3 載體信息

　　載體的名稱和來源，載體特性和安全性，是否可向自然界中不含有該類基因的微生物轉(zhuǎn)移。構(gòu)建載體圖譜，詳細注明表達載體所有元件的名稱、位置和酶切位點。

　　4.4 載體中插入?yún)^(qū)域各片段的資料

　　4.4.1 啟動子和終止子的供體生物的名稱、大小、DNA序列、功能、安全應用記錄；

　　4.4.2 標記基因和報告基因的供體生物的名稱、大小、DNA序列、功能、安全應用記錄；

　　4.4.3 其他表達調(diào)控序列的名稱及其來源（如人工合成或供體生物名稱）、大小、DNA 序列、功能、安全應用記錄。

　　4.5 基因操作方法

　　4.6 遺傳穩(wěn)定性

　　4.6.1 目的基因整合的穩(wěn)定性：采用PCR等方法擴增外源基因片段，測定擴增產(chǎn)物的序列，分析外源基因片段的插入情況或微生物基因缺失情況，提供不少于轉(zhuǎn)接傳代5代的試驗數(shù)據(jù)；

　　4.6.2 目的基因表達的穩(wěn)定性：采用蛋白質(zhì)印記（Western–Blot）、質(zhì)譜、色譜等方法，分析表達產(chǎn)物中外源基因表達的穩(wěn)定性，提供不少于轉(zhuǎn)接傳代5代的試驗數(shù)據(jù)。

　　4.7 目的基因的檢測和鑒定技術

　　4.8 確定基因操作的安全類型

附件1 食品加工用遺傳修飾微生物產(chǎn)品中生產(chǎn)菌株DNA檢測

　　采用PCR方法對生產(chǎn)菌株特定DNA片段（如目的基因、報告基因、標記基因等）進行檢測。PCR方法涉及的樣品采集、DNA提取、PCR擴增和質(zhì)量控制要求如下：

　　1. 樣品采集

　　每個遺傳修飾微生物產(chǎn)品應至少包括3個批次，每個批次至少取3個樣品進行檢測。樣品應從工業(yè)化生產(chǎn)線采集，記錄采樣點所處的具體生產(chǎn)環(huán)節(jié)。若尚無工業(yè)化產(chǎn)品，可采用中試產(chǎn)品，但應明確中試生產(chǎn)工藝（發(fā)酵及后處理工藝）具有工業(yè)化生產(chǎn)工藝的代表性。

　　2. DNA提取

　　從至少1 g（mL）樣品中提取DNA。若上游發(fā)酵中間產(chǎn)品濃度高于終產(chǎn)品濃度，可使用上游發(fā)酵中間產(chǎn)品提取DNA。

　　應采用適合于生產(chǎn)菌株各類細胞形式（如菌體細胞、芽胞）的DNA提取方法，確保能從產(chǎn)品中提取到可能殘留的DNA。

　　3. PCR擴增

　　針對生產(chǎn)菌株的特定DNA片段設計特異性引物，擴增產(chǎn)物不應超過1 Kb。應詳細描述生產(chǎn)菌株的特定DNA片段、特異性引物、聚合酶以及擴增條件等信息。

　　若生產(chǎn)菌株含有作為報告基因/標記基因的耐藥基因，可設計多對引物以確保擴增產(chǎn)物應覆蓋耐藥基因的完整DNA片段。

　　4. 質(zhì)量控制

　　PCR檢測時應當包括以下對照和靈敏度測試：

　　（1）將直接從生產(chǎn)菌株中提取的總DNA作為PCR擴增的陽性對照；

　　（2）不含目的基因的微生物DNA作為陰性對照；

　　（3）試驗過程中為排除PCR抑制劑、核酸酶等的存在，將直接從生產(chǎn)菌株提取的總DNA添加至從樣品中提取的DNA作為PCR擴增的質(zhì)控對照；

　　（4）將直接從生產(chǎn)菌株提取的總DNA梯度稀釋后，分別添加至樣品中，提取DNA并進行PCR擴增，計算檢測限；

　　（5）檢測閾值應不高于10 ng DNA/g（mL）樣品。

附件2 食品加工用遺傳修飾微生物產(chǎn)品中無活體生產(chǎn)菌株評價

　　采用微生物培養(yǎng)法檢測產(chǎn)品中是否存在遺傳修飾微生物活細胞。具體的樣品采集、樣品前處理、培養(yǎng)和觀察、菌落計數(shù)、質(zhì)量控制和鑒定確認要求如下：

　　1. 樣品采集

　　每個遺傳修飾微生物產(chǎn)品應至少包括3個批次，每個批次至少取3個樣品進行檢測。樣品應從工業(yè)化生產(chǎn)線采集，記錄采樣點所處的具體生產(chǎn)環(huán)節(jié)。若尚無工業(yè)化產(chǎn)品，可采用中試產(chǎn)品，但應明確中試生產(chǎn)工藝（發(fā)酵及后處理工藝）具有工業(yè)化生產(chǎn)工藝的代表性。

　　2. 樣品前處理

　　每個樣品至少取25 g（mL）進行前處理后制備檢液。固體樣品：取25 g，加入225 mL滅菌生理鹽水，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1∶10稀釋的檢液。水溶性液體樣品：取25 mL（g），加入225 mL滅菌生理鹽水，混勻后制成1∶10稀釋的檢液。取1 mL上述檢液于適宜的培養(yǎng)基中進行生產(chǎn)菌株活細胞培養(yǎng)檢測，需設定10個平行樣，用于計算1 g（mL）樣品中待測微生物的含量。

　　3. 培養(yǎng)和觀察

　　將上述平皿置于適宜的條件下培養(yǎng)一定時間后，觀察生產(chǎn)菌株存活和生長情況。

　　4. 菌落計數(shù)

　　計算10個平行樣平皿中待測微生物的菌落總數(shù)，并表示為1g（mL）樣品中待測微生物的含量。

　　5. 質(zhì)量控制

　　培養(yǎng)檢測時，每批次樣品應設置陽性對照，即在每批次的1個樣品中接種較低數(shù)量的活體生產(chǎn)菌株（如每個平皿30~300個菌落），以證明所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件適合于產(chǎn)品中活體生產(chǎn)菌株的生長。

　　應考慮檢測方法的特異性，以避免樣品中其他微生物的污染和干擾。

　　6. 鑒定確認

　　結(jié)果報告應提供菌落培養(yǎng)圖片。

　　樣品經(jīng)培養(yǎng)后，若平皿上長出與陽性對照形態(tài)相似的菌落，應通過鑒定確認其是否為生產(chǎn)菌株。